使用RT
中国养猪网讯： 引言
收集和检测猪的唾液样品来做疾病监测的事例逐渐在增加。然而，已证实唾液基质对PCR检测提出了挑战，因为大多数时候会出现假阴性的结果。本研究目的是为了评估特定因素对PRRSV qRT-PCR性能的影响。
材料和方法
从250头5周龄猪中收集总体积为2.2公升的唾液，该猪群已在15日龄预先接种过改良的活PRRSV疫苗(Ingelvac PRRS® MLV，Boehringer Ingelheim Vetmedica，St. Joseph，MO)。在实验室中，汇集样品，不断搅拌混匀，同时等分成25毫升体积，并保存于-80 ℃。
本研究评估的因素包括(图1)：
• 温度1—样品放在4 ℃或者25 ℃解冻24小时。
• 稀释—样品按1:2比例与Trizol或无核酸酶的水混合(总体积=1.5 mL)。
• 超声处理—是和否。如果“是”，样品在水浴超声器中超声处理10分钟。
• 温度2—温度处在超声处理操作时(4 °C和25 °C)。如果超声处理=“否”，样品保持在4 °C或25 °C 10分钟。
• 温度3—温度处在样品停留时(4 °C和25 °C)，直到PRRSV RT-PCR反应完成。
图1显示，实验允许上述所有因素进行直接对比。总体而言，每4个样品有32个处理措施，每个处理措施连同1个阴性对照一起，即，每个循环有32个阴性对照。此过程重复5次，共产生800个PRRSV RT-PCR结果。整个过程监控温度，使用NIST-认证的温度计记录最高和最低温度。
样品于美国爱荷华州立大学兽医诊断实验室测试。使用Ambion公司5X®的MagMAX™病毒RNA试剂盒提取病毒RNA。PCR使用Tetracore EZPRRSV™MPX 4.0 RT-PCR法进行。采用SAS®9.3版本对数回归法对二进制测试结果进行分析。所有因素及其相互作用在模型中均被考虑到。从最终模型中排除微不足道的影响。
结果
检测640份已知的阳性样品，处理后产生85个假阴性结果(灵敏度86.7%)。检测160份阴性对照，结果有1份假阳性(特异性99.4%)。表1显示定性(正/负)结果统计分析的概要信息。比值比估计对温度1(25 ℃和4 ℃)的影响是0.265(0.145，0.447)，这表明当唾液在25 ℃解冻时更可能产生假阴性结果。
结论与讨论
本研究证明，特殊的预提取因素可以显著影响PRRSV定量RT-PCR的检测性能。继续改进反应程序则需要更多的研究。
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